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活性蛋白分离纯化

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  蛋白纯化方法的选择和确定要根据不同蛋白质样品的性质和具体的研究目的来决定。常用于初步提取和浓缩蛋白质的方法主要有吸附法、超滤法、沉淀法(如盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀和选择性沉淀等)、透析法等。在要求高分辨率的条件下,通常采用色谱法(如凝胶过滤、离子交换、亲和色谱和共价色谱等)和电泳法(如等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳和免疫电泳等)。这些分离纯化方法的原理主要是基于蛋白质在溶解性、带电荷性、分子量大小或亲和特异性等方面的差异。色谱技术和电泳技术在纯化蛋白质方面的研究和应用比较广泛、深入。
  华士特生物拥有专业的蛋白纯化专家,完善的技术平台,提供做种蛋白纯化与鉴定方法,一对一服务,满足客户多样化需求,多用纯化与鉴定方法供客户选择,量身设计实验方案,满足客户的个性化需求。
 
  实验流程
 
 
活性蛋白混
 
 
  服务领域及范围
  单一蛋白的纯化、活性蛋白混合物的分离纯化及规模制备
 
  样品要求及项目周期
  以需求量及分离难度而定。欢迎电联或面议。
 
  常用蛋白纯化技术介绍
  目前,离子交换色谱已成为蛋白质分离纯化中最常用的手段,统计显示,在蛋白质的纯化方案中,使用到离子交换色谱的占75%,其次是使用亲和色谱和凝胶过滤色谱,分别占60%和50%。事实上,蛋白质的纯化过程往往是将若干纯化技术联合使用而实现的,在此过程中,选择合理的纯化技术固然很重要,然而如何将这些技术合理的组合和按顺序使用也是进行成功分离所必须考虑的。
 
  1、凝胶过滤色谱
  凝胶过滤色谱技术是蛋白质研究领域内一种高效的分离纯化手段。一方面从理论上讲,蛋白质样品在凝胶柱内几乎和固定相基质不发生任何作用,另一方面样品洗脱液均为含盐或纯水系缓冲液,而且整个操作过程中洗脱液组成不发生变化,所以该技术在分离纯化蛋白质时具有操作方便、洗脱条件温和、重复性好、不需要有机溶剂、样品不易变性和回收率高等诸多优点。
  主要应用:用于蛋白质的浓缩纯化,分子量及其分布范围测定,样品脱盐以及更换蛋白质缓冲液等。
  主要考虑因素:凝胶的参数、体积参数、分配系数和有效分配系数、
 
  2、离子交换色谱
  用离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合,而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同,表现出与离子交换剂在结合强度上的差异,在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。
  离子交换色谱的特点:
  ①分辨率高,随着各种高效色谱介质的出现,选择合适的离子交换剂能够确 保 离 子交换色谱有着良好的选择性和分辨率;
  ②蛋白交换容量高,有利于放大分离规模和在工业生产中应用,而这一点是凝胶 过 滤 等 方 法 很 难 达 到 的;
  ③ 应 用 灵活,通过选择不同的离子交 换 剂,控制缓冲液的组成和 pH、离子强度条件可以优化分离过程;
  ④分离原理比较明确,该技术是依据电荷不同进行分离的,不过对于蛋白质这样的大分子,除了静电作用外,疏水相互作用、氢键等非离子作用以及缓冲离子的性质也会影响到分离行为;
  ⑤操作简单易行,在 大 规模分离样品而分辨率要求又并不高时,对蛋白质进行吸附和解吸甚至可以不用在色谱柱中进行。
 
  3、亲和色谱
  亲和色谱是利用蛋白质分子的生物学活性,而不是利用其物化特性来进行分离,即以蛋白质和配体之间的特异性亲和力作为分离的基础,因而具有高度选择性,其纯化程度有时可高达1000倍以上,因此亲和色谱是一种非常有效的蛋白质纯化方法,多用于从大量的复杂溶液中分离少量的特定蛋白质,且这种纯化方法同时具有浓缩的效果。有时仅用亲和色谱一步分离过程,就能达到快速而且满意的蛋白质纯化效果,这是其他纯化方法所无法比拟的。
  亲和色谱中蛋白质与配体之间的结合类型主要有:酶的活性中心或别构中心通过次级键与专一性底物、辅酶、激活剂或抑制剂结合,抗原与抗体,激素等与其受体,生物素与抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白,糖蛋白与凝集素等的结合。
 
  4、共价色谱
  用来分离蛋白质和其他生物大分子的色谱技术,如离子交换色谱和疏水相互作用色谱都是基于待分离的分子和吸附剂之间的非共价相互作用而实现的,而共价色谱则是应用固定相与溶质之间共价键的形成或断裂来实现分离。
  通常用于生物活性蛋白的色谱技术,要求在温和的条件下,既能形成稳定的键,又能在释放固定蛋白时不破坏其结构。
 
  5、电泳技术
  电泳就是在电场作用下,带电胶体颗粒向着与其电性相反的电极移动,其分离原理是基于生物大分子的电荷密度。
 
 
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